以牛奶为样品对裸磁珠法分离蛋白质和核酸可行性的初步评价

Abstract

新冠疫情流行以来，能否快速提取核酸已经成为控制疫情的关键。为快速、高效地分离核酸，人们开发了以磁性Fe₃O₄为吸附介质的磁珠法。本实验使用牛奶这一简单样品，期望通过一些简单的检验方法评价这一新兴技术，并给出一些建议。分析发现，使用裸磁珠简单实现牛奶中蛋白质或者核酸的分离提纯的方法不可靠。但磁珠产生的类似生色效应的影响不容忽视。

Introduction

核酸提取是分子生物学检测的首要步骤，常用方法有酚-氯仿抽提法、阴离子交换法、硅介质吸附法等。近年来，采用磁性Fe₃O₄为吸附介质的磁珠法，不仅避免了使用有毒有机溶剂，而且可采用磁分离装置实现自动化、批量化操作，逐渐成为核酸提取的主导方法，在医学检验、疾病诊断、基因工程等领域发挥了重要作用。

磁珠法又称磁固相萃取法，是21世纪分离富集领域的革命性技术。Fe₃O₄的粒径分布、表面理化性质和分散性是影响其吸附性能的主要因素。纳米Fe₃O₄比表面积大、表面具有丰富的官能团，既可作为吸附位点直接结合目标物，又可通过表面修饰改善性能。与此同时，为了获得更加稳定的纳米磁珠，人们采取了许多保护手段。其中最主要的是使用SiO2涂层覆盖带有磁性的内核。然而，这些涂层的制备通常需要较长的时间和更加复杂的实验设备，为分离步骤的简化带来了困难。

目前报道了一种使用裸磁珠分离酵母内RNA的成功案例，然而文中一些表述并不是很清晰，且数据较少，可能有些许错误。基于此，本实验将待分离的样品从复杂的酵母细胞更换为另一种更为简单且常见的材料——牛奶，并讨论使用裸磁珠分离蛋白质的可行性。

牛乳中大约含0.5%的含氮物，其中95%为乳蛋白质，5%为非蛋白质含氮物，蛋白质含量大约在32 mg/ml。牛乳蛋白质主要分以下四类：酪蛋白、白蛋白、球蛋白和脂肪膜蛋白，含有25种不同的氨基酸。除此而外，还含有少量酶类。牛乳中核酸含量约为蛋白质的千分之一。

初步实验表明，虽然使用超声条件能够制备得到具有磁性的纳米铁磁珠，但不稳定，容易聚集沉降，在本实验的条件下无法完成牛奶中蛋白质的提取任务。但实验数据中呈现的磁珠对大分子的生色效应及其条件、磷酸缓冲液和大分子相互作用时扮演的角色，仍然值得继续深入研究。

Experiment Part

Experimental Principles

Preparation of Nano Fe₃O₄ Particles

超声已经被证明是一种制备金属氧化物纳米颗粒的有效方法。本实验使用超声辅助反相共沉淀法，期望在空气氛围下快速温和地制备粒径约20 nm的Fe₃O₄。在反相沉淀法中，超声激发出的活性物质能使制得的纳米颗粒展现均一的形貌；而充分的搅拌作用能够保证将混合铁盐逐滴加入碱性溶液时，周围的PH值不至于在局部范围迅速改变。超声波的“空化泡”效应和剪切作用也会进一步抑制粒径生长，加速反应进行。

Rationale

乳蛋白质主要分为酪蛋白、白蛋白、球蛋白和脂肪膜蛋白，其中酪蛋白约占牛乳总蛋白质的78%。由于酪蛋白对宽范围的波长反射，液态牛奶呈现乳白色。在我们的预实验中，除非多次梯度稀释，否则无法直接通过分光光度法检测牛奶中蛋白质的含量，且难以绘制标准曲线作为定量对照。

当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀，得到含有较少蛋白质的上清液。硫酸铵作为蛋白质沉淀剂往往用于处理新鲜组织提取液，获得具有活性的蛋白质沉淀，且具有效果明显、沉淀PH范围广、溶解度高、溶液散热少、较为经济等优点。本实验通过先预处理牛奶样品，利用硫酸铵使蛋白质盐析，离心得到上清液，作为磁珠吸附的蛋白质原液。

核酸和蛋白质均是生物大分子，有着复杂多样的结构。而纳米Fe₃O₄能够通过表面官能团静电、氢键以及配位作用吸附种类广泛的基团。而对于核酸含量只在10-3 mg/ml量级的牛奶体系，对核酸的吸附大约可以忽略。磷酸盐能够破坏上述作用，置换出原本吸附的大分子，让目标产物再次进入溶液。

核酸和蛋白质中均存在共轭结构，分别在260 nm和290 nm附近有强吸收。可用紫外光度法测定其含量，评价吸附及解吸情况。

Materials and Equipment

六水三氯化铁（FeCl₃·6H₂O）、氯化亚铁四水合物（FeCl₂·4H₂O）、13.38 mol/L浓氨水（NH₃）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）、PBS、硫酸铵（(NH₄)2SO₄）、纯牛奶（特仑苏）、钕铁硼强磁铁（国为）、超声仪、离心机、紫外-可见分光光度计、光谱仪。

Procedure

Preliminary Experiment

direct centrifuge of milk

取10 ml牛奶于离心管中，设置2000 r/min，离心10 min，观察牛奶分层情况。

best condition for nano Fe₃O₄ preparation

称量2.0 g FeCl₃·6H₂O（7.5 mmol）和1.5 g FeCl₂·4H₂O（7.5 mmol）用20 ml、50 ml、100 ml水充分搅拌溶解，得到铁盐混合溶液。将超声波清洗器的温度分别设置为室温和60 ℃，功率140 W，将100 ml、1.33 M（浓氨水稀释十倍）、100 ml、3.34 M（浓氨水稀释四倍）的氨水分别置于其中。取20 ml上述铁盐溶液，分别逐滴加入氨水中，加完后继续超声30 min。通过磁分离收集所得沉淀，并用水洗涤至溶液pH近中性。最后，将Fe₃O₄超声分散于100.00 ml水中，测试磁响应性能，取少量测试240 nm - 500 nm吸光度曲线。

Preparation of phosphate buffer

称量1.09 g Na₂HPO₄（0.0077 mol）和1.46 g NaH₂PO₄（0.0122 mol）于100 ml烧杯中，加入100 ml水充分溶解，作为解吸剂备用。取少量测试从240 nm - 310 nm的吸光度曲线。

direct interaction between milk and nano Fe₃O₄

取约5 ml上述磁珠分散液，直接加入约10 ml纯牛奶中，超声5 min后静置吸附30 min。磁分离去除上清液，向残留固体中加入约20 ml磷酸缓冲液，摇匀静置5 min。用磁铁分离固液，取上清液测试其240 nm - 310 nm的吸光度曲线。

Formal Experiment

pretreatment of milk

取两块PBS溶于200 ml蒸馏水中，搅拌均匀，获得PBS缓冲液。使用移液管移取10 ml牛奶样品，搅拌中缓缓（5-10 min）加入10 ml缓冲溶液和13.04 g硫酸铵，加完后继续搅拌20 min，使其充分沉淀。以5000 r/min的转速离心10 min，抽滤，取上清液作为蛋白质原液。

preparation of nano Fe₃O₄

称量2.0 g FeCl₃·6H₂O（7.5 mmol）和1.5 g FeCl₂·4H₂O（7.5 mmol），用50 ml水充分搅拌溶解，得到铁盐混合溶液。不使用超声波清洗器的加热功能（保持室温），设置功率140 W，将100 ml、1.33 M氨水置于其中。取20 ml上述铁盐溶液，逐滴加入氨水中。继续超声30 min，通过磁分离收集所得沉淀，并用水洗涤至溶液pH近中性。最后使用100 ml水超声分散所得产品。

Extraction of RNA and proteins with nano Fe₃O₄ particles

测量蒸馏水在240 nm - 310 nm的吸光度曲线。
取蛋白质原液5 ml，加入1 ml水，测量240 nm - 310 nm的吸光度曲线。
取蛋白质原液5 ml，加入1 ml上述纳米Fe₃O₄分散液，摇匀后超声5 min，静置吸附30 min。磁分离去除上清液，向残留的固体中加入6 ml磷酸盐溶液，摇匀后静置5 min。用磁铁分离固液，取上清液测试其在240 nm - 310 nm的吸光度曲线。
取清水5 ml，加入1 ml上述纳米Fe₃O₄分散液，摇匀后超声5 min，静置吸附30 min。磁分离去除上清液，向残留的固体中加入6 ml磷酸盐溶液，摇匀后静置5 min。用磁铁分离固液，取上清液测试其在240 nm - 310 nm的吸光度曲线。

Results

Pre-experiments

离心后的牛奶在表面和底部均有少量白色沉淀，未在试管下端看到明显的细胞聚集，且其他部分和未经离心的纯牛奶没有明显区别。这表明牛奶中大部分物质以游离形式存在。所以对于核酸，无法通过离心细胞的方式直接分离得到。

纳米四氧化三铁的吸收光谱
饱和吸附蒸馏水
磷酸缓冲液

下图左侧的烧杯放置60℃条件下使用100 ml、3.34 M的氨水制备得到的纳米磁珠，右侧烧杯是室温条件下使用100 ml、1.33 M的氨水制备得到的纳米磁珠。左图为静置10 min后的对比，右图是静置更长时间的对比。

60℃条件下使用100 ml、3.34 M的氨水制备得到的纳米磁珠
室温条件下使用100 ml、1.33 M的氨水制备得到的纳米磁珠

Formal Experiments

蛋白质原液的吸收光谱
蒸馏水对照组的吸收光谱
解吸液的吸收光谱
蛋白质原液吸附后剩余液的吸收光谱

Discussion

Pre

从纳米Fe₃O₄的吸收光谱中可以看出，吸光度从大约280 nm处开始有显著上升，可能不利于蛋白质目标峰形的分辨。而磷酸缓冲液和蒸馏水的全波段低吸收则表明，它们不足以影响蛋白质或者核酸的吸收峰。

探究磁珠合适制备条件时我们发现，室温下使用50 ml水溶解的混合铁盐和100 ml、1.33 M的氨水制备纳米Fe₃O₄，分散效果最好，磁响应性能和其他组也有所提升。第一周预实验中有一组以较为粗放方式制备的磁珠，一周后虽然仍旧在水中保持均匀分散，但磁性基本丧失。而按照60℃的条件制备的产品，在超声分散时在靠近烧杯边缘出现的颗粒肉眼可见，且大约静置10 min就能观察到明显的分离，形貌显然没有达到“纳米”的要求。

制备过程中也观察到，虽然超声能够将磁珠均匀分散至蒸馏水中，但是停止超声后，随着时间的推移，和其他条件较为优良的磁珠产品相比，总是会沉降大部分，只剩下小部分能够继续维持分散状态。这可能是因为虽然在超声仪中能够制得符合条件的纳米Fe₃O₄，然而随着多次的洗涤和分散，没有任何形貌控制手段来限制磁珠的长大，导致纳米Fe₃O₄非常容易聚集沉降，失去了原本的纳米形貌。此外，由于裸磁珠很容易和溶解于水中的氧气接触而被氧化，制得的纳米磁珠也非常不稳定。这也从反面支持了人们通常会在氮气保护下缓慢制备纳米四氧化三铁的方法。

由于使用纯牛奶做饱和吸附时，使用的是温度条件60℃和100 ml、3.34 M的氨水做的纳米铁磁珠，所以出现牛奶解吸液曲线形状和清水解吸液形状基本相同的现象也就不难理解：因为使用的磁珠完全没有达到制备目标的要求，自然也不会对牛奶中的物质有所响应。

Formal

蛋白质原液的吸收光谱符合预期，在波长292 nm处呈现峰值0.607，而无法观察到260 nm附近的核酸吸收峰。可以认为经过硫酸铵处理后的蛋白质原液中，含有能够响应磁珠吸附的足量蛋白质。

从蒸馏水对照组的吸收光谱可以得知，经过磁珠处理的蒸馏水空白对照对应曲线明显高于磷酸缓冲液和蒸馏水的吸收曲线，且在280 nm之前和磷酸缓冲液的吸收曲线相似，不过有不同程度的提升。这一结果说明，磁珠的确可以和磷酸缓冲液发生相互作用，可能可以从已经吸附的磁珠-蛋白质体系中置换出蛋白质。而280 nm以后的强吸收应当和磁珠本身性质关系更密切。不过吸收峰值0.182同样出现在蛋白质的292 nm处，导致除了通过吸收强度的变化外，无法判断磁珠是否对蛋白质有吸附。

在蛋白质解吸液和蒸馏水解吸液的对比中，我们可以清楚地看到在292 nm的地方出现属于蛋白质的峰值0.106——一个远远低于原液、也低于蒸馏水解吸液的结果。首先这证明磁珠法远未完成分离原液蛋白质的任务。其次，曲线和峰值和蒸馏水相比，均有所变化，这说明磁珠和蛋白质之间仍然存在较强的相互作用。可能是因为实验制备的0.2 M、PH=7的磷酸缓冲液对于蛋白质而言不是一个合适的解吸液，导致一些吸附后的蛋白质未能和磁珠分离。从而将微小的磁珠带入上清液。

磁珠法未能完成吸附蛋白质的事实，也被吸附后剩余液的吸收光谱证明：剩余液在292 nm处的吸收值甚至高于原液，增加到了1.577，并在304 nm处达到最高的2.44。如果说304 nm的吸收峰可以被仍然留存在溶液中的少量纳米磁珠解释，但292 nm处、甚至之前全波段吸收的大幅增加则着实令人费解。但是可以肯定，磁珠显著影响了蛋白质原液中的某些物质，产生类似生色效应的效果。同时，和预实验中磁珠分散液的吸收光谱对比，可以认为因未完全分离而残余在清液内的磁珠，不足以主导240 nm - 280 nm的吸光值。

值得关注的是，在258 nm处能明显观察到0.8的吸收值——靠近核酸的预测吸收波长，而此处的吸收峰是在前面任何一个吸光曲线都没有出现的。然而核酸吸收峰却出现在剩余液中，这表明应该和蛋白质的情况一样，磁珠和核酸结合后充当生色基团，显著增加了核酸的吸收值。但是磁珠无法通过磷酸缓冲液实现分离，从而随核酸一起，分散在剩余液中。

Conclusion

本实验通过一些基于牛奶的简单实验，测试了文献中报道的裸磁珠分离技术。基本可以肯定，超声制备裸磁珠的60℃条件不可行。而不稳定的裸磁珠的使用，在实现牛奶中蛋白质的分离提纯上效果堪忧。不仅如此，蒸馏水空白对照的吸收峰和蛋白质峰位置的重合，让人更加难以判断磁珠是否能够真正吸附蛋白质。实验制备的磷酸缓冲液对于蛋白质而言，也不是一个良好的解吸剂。

然而，实验的一些意外发现也值得后来者继续深究。

第一处，是蛋白质解吸液的光谱吸收显著低于空白蒸馏水的解吸液；但剩余液的吸收远高于蛋白质原液的明显对比。如果认为磁珠对蛋白质有增强吸收的生色效应，那么解吸液和剩余液的情况应该相同，即蛋白质解吸液的吸收也应当高于蒸馏水的解吸液。这很有可能是加入的磷酸缓冲液造成的：未加缓冲液时磁珠增强吸收；加入缓冲液后磁珠抑制吸收。

第二处，是在剩余液吸收光谱中出现的靠近核酸吸收的可疑峰。猜测是因为一定尺寸的磁珠和核酸结合后充当生色团，显著增加了核酸的吸收值。由于磁珠无法通过磷酸缓冲液实现分离，从而随核酸一起，分散在剩余液中。结合等浓度核酸吸收峰值约为蛋白质十倍的事实，纳米Fe₃O₄对核酸的生色效应的猜测很有可能成立。这需要使用红外光谱得到磁珠表面情况。

Acknowledgement

蛋白质原液的获得方法由张成涛同学设计提供，并由他制备。在预实验和正式实验的实验设计和更改中也给予了本文作者莫大帮助。

实验设计和操作过程中也得到了来自何元毅助教和刘红瑜老师的修改建议和大力支持，在此一并感谢。

Possible Questions

由于在讨论和操作过程中遭遇了许多未曾设想的阻力，本文和最初的设计区别较大。

在配制100 ml、0.2 M的磷酸缓冲液（PH=7）时，由于没有查到现成的比例配方，所以采取去公式化的精确求解方法。即以溶液中电荷守恒式（Charge Balance Equation）为中心，通过分部分数化简方程，再使用MATLAB求解。具体参见邵利民《分析化学（第二版）》。

为使用实验室提供的NaH₂PO₄和Na₂HPO₄配制总浓度0.2 M、PH=7（[H+]=[OH-]=10-7）的磷酸缓冲液，计算可得NaH₂PO₄和Na₂HPO₄物质的量之比约为1.58。通过简单的代数计算，即可得到Na₂HPO₄需要1.09 g、NaH₂PO₄需要1.46 g。

放置一周仍然保持良好分散性能的一组纳米Fe₃O₄，除了条件是室温、铁盐使用50 ml水溶解以外，还有可能是因为那一次是等待一滴混合铁盐溶液反应完全后，再滴加下一滴。滴入铁盐的快慢对磁珠性质是否有影响仍然是未知数。

原始数据和相关的图片视频保存在随文附带的文件夹中。